云海生物 GMP 级 Lenti-CAR 标准

        嵌合抗原受体慢病毒载体（LV-CARs）产品检定项目、检定方法及检定标准如下表：

1. 微生物检查

        对常规的细菌做高通量核酸质谱检测。

        取待测样品分别接种于需气菌、厌气菌培养基6管，接种金黄色葡萄球菌对照菌液1ml，作阳性对照，并将需气菌、厌气菌培养基管放置于30-35℃、真菌培养基管放置于20-25℃培养7日。在培养期间逐日观察并记录是否有菌生长。阳性对照管在24小时内应有菌生长。

        若在培养基中培养7天后，无菌生长；或培养7天后,从外观上不能判断是否有菌生长，再取该培养液适量，重新接种至此前种类的新鲜培养基中或斜面培养基上继续培养，衣原体培养1日，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否有菌生长。或用接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。若观察无菌，则表明待测样品中无菌。

2. 支原体检查

        对支原体做核酸质谱检测。

        按要求配制适合支原体生长的相关培养基，1.0ml供试品接种10ml的支原体培养基，36±1℃观察7-28天。每三天检查一次。

        培养结束时，如接种待测样品的培养基均无支原体生长，则待测样品中不存在支原体；如疑有支原体生长，可取加倍量待测样品复试，如没有支原体生长，则待测样品中不存在支原体，如仍有支原体生长，则待测样品中存在支原体，判定为不合格。

3. 内毒素检查

        通过检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出的呈色团多少而测定内毒素含量。

        采用试剂盒提供的标准品制备标准曲线，并测定545nm处的吸收度。

        依据读取的待测样本吸光值，代入线性回归方程，即可计算出其内毒素含量，对于稀释的待测样，将相应数值乘以稀释倍数即可。

4. RCL/复制能力 

        将病毒感染细胞后，持续换液至少4天，之后使用P24 ANTI-HIV1试剂盒检测病毒颗粒，或者qPCR检测病毒滴度。结果需无病毒检出。

5. 总DNA残留量

        配制2管标准溶液及荧光反应体系，然后分别在对应体系中加入标准溶液和待测样品，并在荧光仪上读取标准溶液和待测样品的荧光值。结果：将荧光仪上读取的数据带入公式，即可计算出DNA残留量。

6. 感染滴度

        利用荧光信号累积实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行定量。

        将待测样品感染24孔细胞，适当时间后收集已感染病毒的细胞液，采用细胞基因组DNA提取试剂盒，抽提基因组。

        并将抽提基因组和已配制的标准品溶液加入相应的PCR反应体系中，通过qPCR仪进行扩增，并读取相应数据。制作标准曲线，并将qPCR仪读取数值带入公式进行计算即可。

7. pH

        pH检查使用pH试纸（pH范围6.0-8.0）进行颜色比对。

8. 外观

        外观检查需在照度＞2000lux的灯光下肉眼检查，观察溶液颜色、溶液澄清度，并检查有无异物。